Sintesi del cDNA da RNA privo di contaminazione da DNA genomico

Sintesi del cDNA da RNA privo di contaminazione da DNA genomico
/ Team Microtech

La sintesi del cDNA è il primo step per molti protocolli in biologia molecolare, in particolare nell’analisi di espressione genica mediante PCR e Real-time PCR (qPCR). Tutti i passaggi successivi richiedono che la fase di sintesi produca un cDNA altamente fedele che rappresenti accuratamente il DNA target. L’avvento dei kit di sintesi del cDNA ha reso la trascrizione inversa più facile e veloce con un’elevata riproducibilità. Due importanti considerazioni vanno fatte nella scelta di un kit per la sintesi del cDNA: il tipo di primer e la trascrittasi inversa. Inoltre è necessario che l’RNA sia privo da contaminazione di DNA genomico (gDNA). Falsi positivi e alterazioni nell’espressione dei geni sono il risultato di un utilizzo di RNA contaminato da gDNA. Di qui la necessità di eliminare la contaminazione da gDNA dai campioni di RNA. La digestione con desossiribonucleasi I (DNasi I) in vitro rappresenta il metodo più efficace per rimuovere la contaminazione da gDNA nei campioni di RNA. Purtroppo, la rimozione o l’inattivazione di questo enzima dopo la digestione risulta essere problematica.

Per disattivare l’enzima, generalmente, vengono usate metodologie che si basano su temperature elevate, l’utilizzo di agenti chelanti, il trattamento con proteinasi K seguito da estrazione con fenolo/cloroformio. Tutte queste metodologie non sono molto efficaci e spesso sono dannose per l’integrità dell’RNA. Alcuni kit di purificazione di RNA prevedono uno step nel quale il trattamento con DNasi viene fatto direttamente sulla spin column. Questa metodica, però non risulta efficiente per campioni biologici che presentano grandi quantità di DNA, per i quali è necessario eseguire il trattamento in vitro.

Il kit OneScript cDNA Synthesis di Abmgood è un sistema pratico ed efficiente per la sintesi del cDNA a singolo filamento. Utilizza la trascrittasi inversa OneScript ed è provvisto di AccuRT, per l’eliminazione di gDNA contaminante i campioni di RNA. AccuRT fornito nel kit OneScript cDNA Synthesis rimuove efficacemente il gDNA contaminante dal campione in meno di 10 minuti, senza perdita o degradazione dell’RNA. A seguito di questo passaggio, l’RNA può essere retrotrascritto. Il cDNA prodotto può essere usato in applicazioni quali PCR e qPCR.

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