Contaminazione di campioni di RNA da DNA genomico

Contaminazione di campioni di RNA da DNA genomico
/ Team Microtech

Per estrarre RNA da campioni biologici si utilizzano reagenti specifici e kit basati sull’uso di colonnine (spin column). Nessuna metodica di isolamento dell’RNA, però, assicura che l’RNA sia privo di contaminazione da DNA genomico (gDNA). La presenza di gDNA in campioni di RNA rappresenta un problema quando l’RNA deve poi essere utilizzato in applicazioni quali la RT-PCR e la qRT-PCR. Falsi positivi e alterazioni nell’espressione dei geni sono il risultato di un utilizzo di RNA contaminato da gDNA. Di qui la necessità di eliminare la contaminazione da gDNA dai campioni di RNA. La digestione con desossiribonucleasi I (DNasi I) in vitro rappresenta il metodo più efficace per rimuovere la contaminazione da gDNA nei campioni di RNA. Purtroppo, la rimozione o l’inattivazione di questo enzima dopo la digestione risulta essere problematica.

I metodi più comunemente usati per l’inattivazione dell’enzima (inattivazione termica, agenti chelanti quali l’EDTA, il trattamento con proteinasi K seguito da estrazione con fenolo/cloroformio) sono inefficaci e persino dannosi per l’integrità dell’RNA, oltre al fatto che si perdono grandi quantità di RNA (si pensi a quando si ha a disposizione di piccole quantità di RNA ottenute da campioni biologici di piccole dimensioni). Un’alternativa è rappresentata dall’utilizzo della DNasi direttamente sulla spin column, anche se questa metodica non è efficiente per campioni con grandi quantità di DNA, quali milza e timo per i quali è necessario il trattamento in vitro.

AccuRT Genomic DNA Removal Kit di Abmgood si basa su un metodo molto semplice e rapido (10 min) ed elimina il gDNA efficacemente senza perdita o degradazione dell’RNA. Non è richiesta l’inattivazione termica dell’enzima. L’RNA trattato è compatibile con varie applicazioni quali RT-PCR, qRT-PCR, microarray, Northern ed altro.

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